《国家级实验示范中心配套教材：微生物学实验》共分八章，第一章介绍微生物的个体形态观察；第二章为微生物的分离和纯培养；第三章为微生物的生长和数 量的测定；第四章为微生物的生理生化反应：第五章为微生物的遗传与育种；第六章为细菌的血清学鉴定：第七章为分子微生物学基础；第八章为应用微生物学实 验，总计61个实验。最后为附录，包括常用微生物名称、常用培养基配方、常用试剂和溶液的配制、常用染色液和配制等。
《国家级实验示范中心配套教材：微生物学实验》为大学本科微生物学实验教材，供高等学校生物科学、生物技术、生物工程、发酵工程、植物科学和生产类各专业学生及科研、生产单位相关人员参考。
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杨民和主编的《微生物学实验》内容介绍：本书共分8章61个实验，包括：微生物的形态观察、分离和纯培养、生长和数量的测定、生理生化反应、遗传与育种、血清学鉴定、分子微生物学和应用微生物学等。每个实验列出实验原理、目的要求、实验器材、方法和步骤、结果与分析、注意事项和思考题等内容。书后有附录和参考资料。
第一章 微生物的个体形态观察
实验1 细菌的简单染色及形态观察
【实验原理】
细菌菌体微小且透明，在光学显微镜下，特别是在油镜下，菌体与背景没有显著的明暗差，很难看清菌体形态。若菌体染色，则菌体折光率增大，其形态易于观察。
细菌染色的染料是一类苯环上含有发色基团和助色基团的化合物。发色基团使化合物具有染色能力；助色基团有电离特性，可以与被染物结合，使被染物着色。染色的染料分为碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白的等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等碱性染料使其着色。酸性染料带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，易被伊红、刚果红或酸性复红等酸性染料着色。中性染料又称复合染料，是前两类染料的结合物，如伊红美蓝、伊红天青等。
简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色以显示其形态的一种方法。
该方法操作简便，适于观察细菌的一般形状及排列，但不能辨别细菌细胞的构造。
【实验目的和要求】
1.了解简单染色法的基本原理，并掌握其操作方法；
2.掌握油镜的使用及无菌操作技术；
3.初步认识细菌的形态特征。
【实验器材】
1.菌种大肠杆菌（Escherichiacoli）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）。
2.染色液碱性美蓝染液、结晶紫染液。
3.器材显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、香柏油、二甲苯、生理盐水、擦镜纸等。
【实验方法与步骤】
简单染色法的基本程序如下：涂片干燥固定染色水洗干燥镜检
1.涂片在干净的载玻片中央滴加一小滴生理盐水或用接种环挑3或4环生理盐水，然后在无菌操作条件下，用接种环从斜面上挑取少量菌种于载玻片上的生理盐水中，混匀并涂成薄膜，涂布面积为1～1.5cm2。
2.干燥涂片可以放在空气中自然干燥；若要使干燥速度加快，可在酒精灯上方加温，但勿紧靠火焰。
3.固定待涂片干燥后，手持涂片一端，有菌膜的一面向上，在酒精灯火焰上通过2或3次，待冷却后，再加染料。
4.染色将涂片水平放置，在菌膜部位滴加染色液（以恰好覆盖菌膜为宜），染色1～2min。
5.水洗倾去染液，斜置涂片，用细水流的自来水冲洗（切勿用自来水直接冲洗菌膜部位），直至洗下水呈无色为止。
6.干燥将水洗的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干，注意不要擦撩菌体。
7.镜检待涂片干燥后，先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，找出适当的视野后，将高倍镜转出，在菌膜部位上加香柏油一滴，然后将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。镜检完成后，用擦镜纸滴加二甲苯1～2滴，擦干净油镜镜头上残留的香柏油，保持镜头的干净。
【结果与分析】
绘制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌体形态图。
【注意事项】
1.涂片时，生理盐水及菌体不宜过多，涂片要均匀，不宜过厚。
2.水洗时，水流不宜过大、过急，以免涂片薄膜脱落。
3.热固定时温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。
【思考题】
1.为什么染色前需要进行菌体固定？
2.为什么固定时只能微加热？若加热温度过高、时间过长，会出现什么问题？
3.为什么要待涂片完全干燥后才能使用油镜进行观察?
4.为什么镜检完成后必须清除残留在油镜镜头上的香柏油？
实验2细菌的革兰氏染色法
【实验原理】
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的一个重要特征，它是1884年由丹麦医生C.Gram创立的。革兰氏染色法（Gramstain）不仅能观察到细菌的形态，而且还可将细菌分为染色反应呈蓝紫色的革兰氏阳性（G+）菌，染色反应呈红色的革兰氏阴性（G?）菌。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
【实验目的和要求】
1.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性；
2.掌握革兰氏染色方法。
【实验器材】
1.菌种培养18～24h的大肠杆菌（Escherichiacoli）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus）、待测菌一种。
2.药品乙二酸铵结晶紫染液、卢戈氏（Lugol）碘液、95%乙醇、番红复染液、无菌水。
3.用具载玻片、接种环、镊子、酒精灯、火柴、洗瓶、废液缸、吸水纸、显微镜等。
【实验方法与步骤】
1.涂片将培养18～24h的3种菌分别用接种环涂3条带于清洁载玻片上（注意涂片不宜过厚），风干、固定（通过火焰1或2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜）。
2.染色
（1）初染：滴加乙二酸铵结晶紫染液覆盖涂菌带，染色1～2min，水洗至洗出液无色。
（2）媒染：滴加卢戈氏碘液冲去残水，并覆盖约1.0min，水洗至洗出液无色。
（3）脱色：将载玻片上面的水用吸水纸吸干，在白色背景下滴加95%乙醇洗至洗出液无色时（20～30s），立即用水洗去乙醇，用吸水纸吸干。
（4）复染：用复染剂（番红）染色10s，水洗。
（5）镜检：吸干或风干后，油镜观察。
【结果与分析】
实验结果革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。检视实验中3种菌各染成什么颜色？它们是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌？将实验结果记录在表2-1中。
【注意事项】
1.染液要求新配制，放置时间不宜过长，卢戈氏碘液易褪色失效，必须装在棕色试剂瓶内并放于暗处保存。
2.革兰氏染色的关键在于严格掌握95%乙醇脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌，因此脱色时间一定要把握好。
3.菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌已自行溶解，都常呈阴性反应，因此一定要确保实验菌的菌龄。
【思考题】
1.革兰氏染色中涂片为什么不宜过厚？染色成败的关键步骤是哪一步？
2.对未知菌种进行革兰氏染色时，如何保证染色技术操作正确、结果可靠？
实验3细菌的芽孢染色
【实验原理】
芽孢为某些细菌细胞在不良的环境条件下产生的休眠体，芽孢壁厚、透性低、不易着色，而一旦染上颜色以后难以脱色。
芽孢染色主要是利用不同的染料进行染色，使芽孢和营养体呈不同的颜色。
在加热条件下，用着色力强的染料对芽孢进行染色，菌体也会着色，然后水洗，芽孢染上的颜色难以被洗脱，而菌体会脱色。然后用对比度大的复染剂对菌体染色，菌体染上复染剂颜色，芽孢仍为原来的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。
【实验目的和要求】
1.学习并掌握细菌的芽孢染色法；
2.了解并观察细菌芽孢的结构和形态。
【实验器材】
1.菌种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、生孢梭菌（Clostridium sporogenes），在适宜的生长温度下培养20h。
2.药品5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液、二甲苯、香柏油、蒸馏水、95%乙醇。
3.用具显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、擦镜纸、吸水纸等。
【实验方法与步骤】
1.制片取清洁载玻片，在中央滴一滴蒸馏水，用接种环无菌操作从枯草芽孢杆菌斜面上挑一环菌置于载玻片液滴上，小液滴呈混浊状即可，并按常规方法干燥、固定（每隔几秒在酒精灯火焰上过一次）。
2.加热染色往载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽（此时计时）并维持5.0min，加热时注意补充染液，勿让涂片干涸。
3.脱色待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。
4.复染用0.5%的番红水溶液复染1.5～2.0min。
5.水洗用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。
6.镜检待载玻片自然干燥后（可在酒精灯火焰上每隔几秒过一次）油镜镜检，观察芽孢的形态。
【结果与分析】
按表3-1记录实验结果。
【注意事项】
1.芽孢染色用的菌种应控制菌龄，幼龄菌尚未形成芽孢，老龄菌芽孢囊破裂。
2.从试管中取菌液时，应先用接种环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌体沉于管底，涂片时菌体太少。
3.对芽孢进行孔雀绿染色后，一定要等玻片冷却后方可用水冲洗。
【思考题】
1.芽孢染色法为什么需要加热？加热染色时为什么必须维持在染液微冒蒸汽的状态？
2.脱色反应中，为什么必须用缓流自来水冲洗？
实验4细菌的鞭毛染色及运动性观察
【实验原理】
鞭毛是细菌的运动“器官”，细菌是否具有鞭毛，以及鞭毛着生位置和数目是细菌分类鉴定的重要依据之一。细菌的鞭毛一般都很纤细，其直径通常为10～20nm，除了很少数能形成鞭毛束（由许多根鞭毛构成）的细菌可以用相差显微镜直接观察到鞭毛束的存在外，细菌的鞭毛一般均不能用光学显微镜直接观察到，而只能用电子显微镜观察。光学显微镜观察细菌鞭毛，必须用鞭毛染色法。
鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，使它沉积在鞭毛上，从而使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由单宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。本实验主要介绍硝酸银染色法和改良的Leifson染色法，前一种方法更容易掌握，但染色剂配制后保存期较短。
在显微镜下观察细菌的运动性，可以初步判断细菌是否具有鞭毛。通常使用压滴法或悬滴法观察细菌的运动性。与鞭毛染色法相比，该方法可以较快速、简便地判断细菌是否具有鞭毛。观察时，要适当减弱光强度以增强反差，若光线太强，细菌和周围的液体难以区分。
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