《高等医药院校基础医学实验教学系列教材:生物化学与分子生物学实验(第2版)》分为基本实验操作及常用仪器使用、经典验证性实验、综合性实验和创新性实验共四篇。在基础理论知识方面,对生物化学与分子生物学的经典研究技术、基本实验操作和常用仪器使用均进行了详细介绍。在实验项目设置上,包括蛋白质定量、层析、电泳、酶学、糖类与脂类、核酸分离纯化、PCR、分子克隆、分子杂交以及RNA干扰、双向电泳、EMSA和ChIP等经典验证性实验、综合性实验和创新性实验。教材内容新颖,体系完整,有所侧重,便于选择。
《高等医药院校基础医学实验教学系列教材:生物化学与分子生物学实验(第2版)》可供医学院校临床医学等各专业五年制、七年制和研究生学生使用,也可供相关专业的科研、教学和技术人员参考。
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实验教学是高等医学教育的重要内容,是培养学生实践能力和创新精神的重要环节。生物化学与分子生物学实验技术是生物医学诸多学科的重要研究手段,也是医学类各专业、各层次学生必修的一门基础实验课程。为适应高等医学院校基础医学实验教学改革和发展的形势,我们按照重庆医科大学基础医学实验教学改革的统一部署和要求,编写了这本实验教材。
本教材一共分为四篇。第一篇是基本实验操作及常用仪器使用,重点介绍了一些目前常用的生物化学与分子生物学研究技术和常用仪器的使用方法以及基本的实验操作要求,目的在于使学生对生物化学与分子生物学的研究技术有一个系统的认识。第二篇是经典验证性实验,开设了一些经典的生物化学与分子生物学实验,这些实验均经过长期的实验教学实践,证明有助于学生巩固理论知识和培养学生基本的实验操作能力。第三篇是综合性实验,每个实验均涉及多种实验技术的使用,通过相对系统地使用多种实验技术来解决一个问题或达到一个研究目的,以培养学生的综合性逻辑思维能力,对科学研究有一个初步的认识。第四篇是创新性实验,通过由学生自己提出问题、解决问题的方式,以培养学生独立思考和基本的科研能力。
本教材各部分实验的编写均由多年从事生物化学与分子生物学教学及科研的学术带头人和中青年骨干教师执笔。另外,在实验项目的设置上,我们也选取了一部分目前科学研究中经常使用的实验技术,如功能基因组学研究中常用的RNA干扰实验、蛋白质组学研究中常用的双向电泳实验以及转录调控研究中常用的启动子活性分析实验、EMSA实验和ChIP实验等,并注重实验的可操作性与实用性。
本教材不仅适合医学院校临床医学等各专业五年制、七年制和研究生学生使用,而且也可供相关专业的科研、教学和技术人员参考。
由于编者水平有限,时间仓促,教材中不当或错误之处在所难免,恳请同行专家和同学们批评指正,以便再版时修正完善。
目录
第一篇 基本实验操作及常用仪器使用
第1章 生物化学常用研究技术(1)
第2章 分子生物学常用研究技术(18)
第3章 基本实验操作(23)
第4章 常用仪器使用(34)
第5章 实验室规则及安全防护(46)
第6章 如何撰写实验报告(48)
第二篇 经典验证性试验
第1章 蛋白质定量实验(49)
实验一 双缩脲法测定血清蛋白质含量(50)
实验二 Folin-酚试剂法测定蛋白质含量(52)
实验三 紫外分光尤皮法测定蛋白质含量(54)
实验四 考马斯亮蓝结合法测定蛋白质含量(57)
实验五 BCA法测定蛋白质含量(57)
第2章 层析实验(61)
实验六 纸层析法观察转氨基作用(61)
实验七 葡聚糖凝胶柱层析分离血红蛋白与鱼精蛋白(63)
实验八 离子交换层析分离混合氨基酸(66)
实验九 薄层层析分离鉴定氨基酸(68)
第3章 电泳实验(72)
实验十 血清醋酿纤维薄膜电泳(72)
实验十一 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清LDH同工酶(76)
实验十二 SDS-PAGE测定蛋白质的分子量(81)
第4章 酶学实验(86)
实验十三 血清碱性磷酸酶活性测定(86)
实验十四 血清丙氨酸氨基转移酶活性测定(89)
实验十五 影响且是蛋白酶作用的因素(92)
实验十六 丙二酸对琥珀脱氢酶的竞争性抑制作用(95)
实验十七 酶的非竞争性抑制作用(98)
实验十八 酶米氏常数的测定(100)
第5章 糖类与脂类(103)
实验十九 血糖浓度的测定(103)
实验二十 肾上腺素对血糖浓度的影响(106)
实验二十一 血清甘油二醋浓度测定(108)
实验二十二 血清总胆固醇浓度测定(112)
实验二十三 血清载脂蛋白apoA1的测定(117)
第6章 核酸分离纯化技术(120)
实验二十四 基因组DNA的提取制备与检测(120)
实验二十五 全血基因组DNA的试剂盒法提取制备与检测(124)
实验二十六 总RNA的提取制备与检测(124)
实验二十七 质粒DNA的提取制备与检测(131)
实睡二十八 动物组织核酸的提取及成分鉴定(137)
第7章 Pα技术(140)
实验二十九 常规PCR技术(140)
实验二十 定量PCR技术(144)
第8章 分子克隆技术(148)
实验三十一 DNA的限制性酶切与电泳检测(148)
实验三十二 凝胶中DNA片断的纯化回收(151)
实验三十二 DNA连接实验(153)
实验三十四 感受态细胞的制备(157)
实验三十五 重组DNA转化与蓝白斑筛选(159)
第9章 分子杂交技术(162)
实验三十六 Southern印迹杂交(162)
实验三十七 Northern印边杂交111111(166)
实验三十八 Western印迹(169)
实验二十九 核酸原位杂交(172)
附 核酸分子探针的标记(177)
第三篇 综合性实验
实验一 血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定(180)
实验二 碱性磷酸酶的分离纯化与动力学研究(186)
实验三 β肌动蛋白基因的克隆(193)
实验四 hCS在大肠埃希菌中的表达、纯化与鉴定(200)
实验五 hCS基因在毕赤酵母中的表达及鉴定(206)
实验六 荧光原位杂交实验(210)
实验七 双脱氧链末端合成终止法测定DNA序列(213)
实验八 肤或蛋白质N-端氨基酸序列测定(219)
实验九 用双荧光素酶报告基因检测启动子活性(228)
实验十 电泳迁移阻滞实验(232)
实验十一 染色质免疫沉淀(237)
实验十二 蛋白质双向电泳(242)
实验十三 酵母双杂交实验(247)
实验十四 RNA干扰实验(250)
第四篇 创新性实验
实验一 重要蛋白质或酶的分离纯化(255)
实验二 糖尿病的生化及遗传检测分析实验(255)
实验三 家族性高胆固醇血症的诊断(256)
实验四 血友病的分子诊断(258)
实验五 RNA干扰技术靶向沉默目的基因(259)
(一)基本原理
所有的层析系统都由两个相组成,即固定相和流动相。固定相或者是固体物质或者是固定于固体物质上的某些成分,而流动相指的是可以流动的物质,既可以是水或各种有机溶媒及其混合物,也可以是各种气体。待分离的混合物进入层析系统时,混合物各组分随着流动相通过固定相,由于混合物各组分的理化性质存在差异,与两相的相互作用(吸附、溶解、结合等)的能力不同,导致它们在两相中的分配比不同。各组分随着流动相不断向前移动,实现在两相中的再分配。与固定相相互作用力较弱的组分,随流动相移动时受到的阻力较小,向前移动的速度较快,优先流出层析系统。反之,与固定相相互作用力较强的组分,向前移动的速度较慢,流出层析系统的时间晚。然后分别收集代表各单一组分的流出液,实现组分分离。
(二)层析技术分类与应用
按照层析的分离相状态分类,可以分为气相层析、液相层析和超临界层析。气相层析是以气体为流动相的层析方法,根据固定相的性质不同又可分为气-固层析和气-液层析。前者是指载体表面含有许多吸附基团的固体吸附介质,后者是指载体表面涂有一层液体分子制成的介质。液相层析是以液体为流动相的层析方法,同样可根据固定相的性质不同把液相层析分为液-固层析和液-液层析。超临界层析是以流体为流动相的层析方式,它是利用流动相溶剂分子的气态和液态临界点的条件下进行分离的,这种分离方法更具专一性。
按照层析操作形式分类,可以分为柱层析、薄层层析、纸层析、薄膜层析等。例如,薄层层析是在玻璃板上涂布一层支持剂,待分离样品点在薄层板一端,然后让推动剂从上流过,从而使各组分得到分离的物理方法。薄层层析设备简单,操作简便,快速灵敏。改变薄层厚度,既可作分析鉴定,又能作少量制备。配合薄层扫描仪,可同时做到定性定量分析,在生物化学、植物化学等领域是一类广泛应用的物质分离方法。
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