《现代工业微生物学实验技术》包含了工业微生物学八大实验技术：工业微生物的显微技术，工业微生物的形态观察，制片及染色技术，工业微生物的纯培养技术，工业微生物的检测技术，工业微生物的生理与发酵实验技术，环境工程的微生物学实验技术，工业微生物的育种技术，工业微生物的基因工程实验技术。《现代工业微生物学实验技术》共设置了49个实验，其中大部分为工业微生物学基本技能训练实验，各相关专业师生在使用时，可根据实际情况加以取舍或精简；还有部分实验为大型综合性实验和研究性实验，可供学生课外科技活动或毕业实践时参考应用。
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本实验教材可作为2015年出版的《工业微生物学教程》（罗立新主编）等主教材的配套实验教材，颇具理工科特色，适合于理工科大学的生物工程、生物技术、生物制药工程、食品科学与工程、食品质量与安全、环境科学与工程等专业的本科生使用，也适合于高等职业技术学院相关专业的专科生使用。
目录
前言
工业微生物学实验规则与安全 1
第一章 工业微生物的显微技术 4
第一节 普通光学显微镜的操作技术 4
实验一 使用普通光学显微镜观察各种微生物标本片 7
第二节 暗视野显微镜的操作技术 10
实验二 使用暗视野显微镜观察活菌体 12
第三节 相差显微镜的操作技术 14
实验三 使用相差显微镜观察啤酒酵母细胞内部结构 17
第四节 荧光显微镜的操作技术 19
实验四 使用荧光显微镜观察酵母菌和细菌的形态结构 20
第五节 电子显微镜的操作技术 22
实验五 透射电镜微生物样品的制备与观察 24
实验六 扫描电镜微生物样品的制备与观察 28
第二章 工业微生物的形态观察、制片及染色技术 31
第一节 酵母菌和霉菌的形态观察及制片技术 32
实验七 酵母菌和霉菌的制片、染色技术及形态观察 36
第二节 细菌和放线菌的形态观察及制片技术 42
实验八 细菌和放线菌的制片、染色技术及形态观察 49
实验九 细菌特殊结构的制片、染色技术及形态观察 55
第三章 工业微生物的纯培养技术 60
第一节 培养基的配制与灭菌技术 60
实验十 培养基的配制和灭菌 64
第二节 无菌操作技术 70
实验十一 无菌操作和微生物菌种的移接 72
第三节 工业微生物的分离与纯化技术 77
实验十二 微生物菌种的分离与纯化 78
实验十三 碱性纤维素酶产生菌的分离纯化 82
实验十四 噬菌体的分离与纯化 85
第四节 厌氧微生物的纯培养技术 89
实验十五 厌氧微生物的纯培养 91
第五节 工业微生物的菌种保藏技术 98
实验十六 工业微生物菌种的保藏 99
第四章 工业微生物的检测技术 105
第一节 微生物生长繁殖的测定技术 105
实验十七 酵母菌细胞数、出芽率及死亡率的测定 108
实验十八 微生物细胞大小的测定 112
实验十九 光电比浊法测定细菌生长曲线 115
第二节 食品安全微生物学检验技术 118
实验二十 水和食品中菌落总数的测定 120
实验二十一 食品中大肠菌群的计数 125
第三节 乳酸菌和双歧杆菌的检验技术 131
实验二十二 食品中乳酸菌的检验 133
实验二十三 食品中双歧杆菌的检验 138
第四节 噬菌体的检测技术 145
实验二十四 噬菌体的检查及其效价测定 145
第五章 工业微生物的生理与发酵实验技术 151
第一节 工业微生物的生理生化实验技术 151
实验二十五 微生物对碳源的利用实验 153
实验二十六 微生物对氮源的利用实验 157
实验二十七 环境因素对微生物生长的影响实验 161
第二节 工业微生物的发酵实验技术 166
实验二十八 酵母菌的乙醇发酵实验 166
实验二十九 短杆菌的谷氨酸发酵实验 169
实验三十 枯草芽孢杆菌的a-淀粉酶发酵实验 172
实验三十一 乳酸细菌的乳酸发酵实验 174
第六章 环境工程的微生物学实验技术 181
第一节 活性污泥微生物的镜检分析 182
实验三十二 活性污泥中菌胶团细菌、原生动物及微型后生动物的形态观察 184
第二节 空气卫生微生物的检测 186
实验三十三 空气中细菌的检测 187
第三节 土壤中微生物数量和组成的测定 189
实验三十四 土壤中微生物的分离和计数 190
第四节 污染物降解菌的分离纯化与性能测定 193
实验三十五 表面活性剂降解菌的富集、分离及降解能力测定 195
实验三十六 酚降解菌的驯化、分离及性能测定 198
实验三十七 光合细菌的分离纯化及对有机废水的处理 199
第七章 工业微生物的育种技术 203
第一节 工业微生物的诱变育种技术 203
实验三十八 应用物理因素诱变选育抗药性的淀粉酶高产菌株 203
实验三十九 应用化学因素诱变选育腺嘌呤营养缺陷型菌株 207
第二节 工业微生物的原生质体育种技术 210
实验四十 酵母菌原生质体的诱变育种 211
实验四十一 酵母菌原生质体的融合育种 214
第八章 工业微生物的基因工程实验技术 217
实验四十二 细菌质粒DNA的小量制备 218
实验四十三 细菌总DNA的提取 220
实验四十四 PCR扩增目的基因 222
实验四十五 质粒DNA的酶切及从凝胶中回收DNA 224
实验四十六 感受态细胞的制备及转化 225
实验四十七 DNA体外重组 227
实验四十八 葡聚糖内切酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 228
实验四十九 纳豆激酶基因的克隆及在酵母菌中的表达 234
主要参考文献 240
工业微生物学实验规则与安全
一、工业微生物学实验目的和要求
1. 工业微生物学实验目的
工业微生物学是一门实践性很强的应用学科，必须在掌握广泛理论基础知识的同时，掌握好扎实娴熟的操作技能，这样才能真正掌握好这门学科。因此，在理工科学校开设工业微生物学实验课程，可以训练学生掌握微生物学基本的操作技能，同时也让学生初步接触学科先进的技术和方法，使学生在有限的时间里系统扎实地掌握微生物学独特的实验操作技术，并将实验技能与实际应用密切联系起来，以更好地服务于相关的工业、农业、食品、环境及医学等领域。通过实验课，培养学生观察、思考、分析问题和解决问题的综合能力；树立严谨、求实的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；培养勤俭节约、爱护公物、相互协作的优良作风。
2. 工业微生物学实验要求
为了上好工业微生物学实验课，确保实验顺利进行，保证实验安全，特别对上工业微生物学实验课的学生提出下列几点要求。
（1）每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验目的、原理、方法和实验步骤，操作时能达到心中有数。只有思路清楚，胆大心细，有条不紊，才不易出现意外的实验效果。
（2）上课时，非必要的物品和书包请勿带入室内，勿随便走动和高声谈话，保持室内安静；关好门窗，以免空气干扰造成污染。
（3）实验操作前需认真聆听教师讲解和观看演示，实验操作时需认真、细心、谨慎。对每次实验的现象和结果要认真仔细观察，对于当前不能得到结果而需要连续观察的实验需记下每次观察的现象和结果，并需及时记下，以便分析和作出正确的报告。
（4）实验需进行培养的材料，一律要求注明班别、组别和日期，有的还需注明实验项目的名称和菌种的名称，并放于教师指定的地点进行培养。
（5）实验微生物培养物均需轻取轻放，小心、严格地按操作规程进行，以免发生意外致容器破损，造成污染。若微生物培养物污染桌面、地面、用具、衣服或皮肤甚至菌液误入口中，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒。
（6）使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。进行高压蒸汽灭菌时，要严格遵守操作规程。负责灭菌的同学在灭菌过程中不准离开实验室，并随时观察灭菌锅工作情况，以免发生意外。
（7）每次实验完毕，必须将实验器材洗净放妥，整理台面，并将实验室收拾整洁，养成良好的实验习惯。凡带菌的器材需经浸泡消毒或高温灭菌后才能清洗。严禁将实验的菌种及器材随意携带到室外。
（8）每次实验结束，应以实事求是的科学态度认真作出实验报告，对异常或不理想的结果需加以讨论，对实验现象作出合理的解释，下次实验时交给指导教师批阅，
二、微生物学实验室的规章制度和安全守则
微生物实验室存在化学方面有毒、易燃、易爆、腐蚀和致癌的危害，有时还存在高压、紫外线和其他辐射的危害。另外，微生物工作者还会受到来自微生物菌株的危害，在处理菌株、载玻片和所有装过或接触过活菌株的容器时要加倍小心。菌株主要通过消化道、呼吸道、皮肤伤口和眼部等部位造成人体的感染（眼睛是感染原进入却不发生局部病理反应的大门），一些微生物菌株甚至可以通过皮肤进入体内。因此，在微生物学实验室进行实验时，实验人员必须遵循微生物操作技术规范，必须符合实验室生物安全守则要求。
1. 微生物学实验室的规章制度
（1）正在进行实验时，由实验室主管限制人员进入。实验人员一律穿工作衣进入实验室，以防衣服被菌污染或被染液弄脏，离开实验室时脱下，并应经常洗干净。留长发者应戴帽或将长发束扎于脑后，以免着火或被污染。
（2）非实验所需物品不得置于实验台上。未经教师许可，不得将实验室内物品带出。
（3）实验室应保持安静，不得高声谈笑，无事不得到处走动。不得在实验室内进食、喝水、抽烟、处理隐形眼镜、使用化妆品。食物应储存于工作区外的专用橱柜或冰箱内。
（4）禁止使用口吸移液管，应使用机械移液装置。制定安全使用和处理锐利器具如注射器针头、手术刀片等的方案。
（5）仔细进行每一步操作，以减少飞溅物或气溶胶的产生。工作台面在每天工作结束前至少应消毒一次，发生生物活性物质泼洒时应及时处理。所用培养物、储存物及其他废物在排放前，应先经过可行的消毒如高压灭菌法处理。
（6）实验后的废物和用过的化学药品分别倾入污物桶或瓷缸内，不得丢入水槽，以免堵塞下水道或腐蚀水管。
（7）要在实验室外临近处进行消毒处理的物品，必须存放在耐用、防扩散的密闭容器中，且必须依据当地及国家的相关规定进行包装后才能从实验室中移出。
（8）实验完毕后，对所用的仪器、工具、标本等，要认真进行清点和擦洗，如有短缺、损坏需填写赔偿报告单。值日生离开实验室前必须将实验室打扫干净，用消毒液擦抹桌面，并检查水、电、窗是否关好。
2. 微生物学实验室的安全守则
（1）对贵重的精密仪器，必须详细阅读仪器说明书后方可使用。实验中所用的试剂，应了解它的性质后再使用。若试剂瓶标签上字迹不清或出现标签脱落时，则试剂必须经过检验，否则不得使用。
（2）在使用有毒物品或易挥发的有毒液体（氰化钾、氢氟酸、二硫化碳等），以及易挥发的强酸、氨或易发生恶臭的物质（硫化铵、硫化氢等）时，必须在排气良好的地方或通风橱中进行；在使用易爆品、浓酸和浓碱，以及其他一些有强烈反应性能的物质时，应戴护目镜和橡皮手套。
（3）吸取有毒液体及浓酸、浓碱时，都不得以移液管用口吸的方式吸取，必须用上端带有橡皮球的移液管或注射器吸取，或用量筒、量杯量取。强酸的浓溶液（盐酸、硝酸、硫酸）或25%的氨水，均应储存在磨口瓶中。
（4）对易爆乙醚不得轻易加热，必须经测试确定其中无过氧化物后方可操作。对盛有易燃、易爆液体（乙醚、苯、二硫化碳等）的瓶子和安瓿，不得放在使用煤气或有电热器的实验室内加热，应放在无火源的通风处使用。一离开实验桌子要熄火。
（5）使用具有爆炸性的试剂时（如苦味酸和多硝基化合物）应特别小心。严防火源、火花，避免猛力冲击和振荡。
（6）危险试剂必须由专人保管和储存。有毒或易爆物品应封闭在铁箱或铁柜中，并由专人保管物品账册和钥匙。
（7）易吸水的试剂（氯化钙、氢氧化钠、氢氧化钾等）必须严封在有盖的玻璃瓶中，用后宜用石蜡封好；见光即发生变化的试剂（硝酸银、磺胺剂、四氯化碳等）应保存在棕色玻璃瓶中，放在阴凉的柜、橱中，避免日光直射；在空气中可以自燃的金属钾、黄磷等，应保存在相应的盛有适当液体的密闭容器中，如金属钾应保存在煤油中，黄磷要放在水中保存。
（8）凡进行易燃、易爆性实验时，所需仪器设备必须符合要求，不得马虎敷衍，以免发生危险。
（9）必须保证实验室的安全，防护器材时刻处于完善待用状态。
（10）其他特殊药品、仪器的安全操作规程，应由教师及有关人员予以补充指导。
第一章 工业微生物的显微技术
第一章 工业微生物的显微技术
微生物最显著的特征就是个体极其微小，人这双肉眼的眼力不足，必须借助于显微镜才能观察到它们的个体形态及内部结构。实际上，正是由于显微技术的建立，才使人类真正认识到丰富多彩的微生物世界。因此，显微技术是一项很重要的技术，熟练掌握显微操作技术是研究微生物不可缺少的手段。现代的显微技术，除用于观察生物体的形态和细微结构外，还可与计算机结合，用于生物体组成成分的定性与定量分析等。
显微镜的种类很多，一般可将它们分为光学显微镜和非光学显微镜两大类。光学显微镜又可分为可见光显微镜和不可见光显微镜两类。可见光显微镜包括明视野显微镜（即普通光学显微镜）、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和偏光显微镜等，其中以普通光学显微镜最为常用；不可见光显微镜包括X射线、红外光、紫外光等显微镜。非光学显微镜包括透射电子显微镜、扫描电子显微镜及超声波显微镜等。
本章将对目前微生物学研究中最常用的普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜和荧光显微镜的操作技术进行介绍，对于电子显微镜（电镜）则侧重介绍其生物标本的制作特点和基本技术。通过以下几个实验，使学生对不同类型的显微镜能有比较全面的了解，并能根据所要观察微生物的种类和情况，选择适当的显微镜进行观察，基本上能掌握观察微生物个体形态和细胞结构的显微技术。
本章的主要内容包括：①普通光学显微镜的操作技术；②暗视野显微镜的操作技术；③相差显微镜的操作技术；④荧光显微镜的操作技术；⑤电子显微镜的操作技术。本章共设置6个实验，除实验一为学生必修的基础性实验外，其他5个显微技术实验可根据实际情况加以取舍或精简。
第一节 普通光学显微镜的操作技术
普通光学显微镜（以下简称显微镜）（图1-1、图1-2）是一种具有高度放大作用的光学仪器，它的分辨率（分辨两点或两根细线之间最小距离的能力）最高可以达0.2μm，而人的眼睛对明视距离的最高分辨率仅有0.1mm，即100μm。微生物的个体很微小，一般是以微米（μm）来描述的。人们要研究微生物的个体形态和细胞结构，单凭肉眼的眼力是远远不够的，必须借助于显微镜，它能使人眼的分辨率提高500倍。因此，显微镜是微生物学必不可少的常用工具，人们必须了解清楚显微镜每一部件的结构和功用，熟练掌握它的操作技术。
图 1-1 普通光学显微镜（单筒式） 图 1-2 普通光学显微镜（双筒式）
图1-3 普通光学显微镜的构造图
普通光学显微镜的结构可分为两大部分（图1-3）：机械装置和光学系统。机械装置保证光学系统的准确配置和灵活调控，是显微镜的基本构架；光学系统直接影响着显微镜的性能，是显微镜的核心组件。
1. 机械装置
（1）镜座：显微镜的底座，起支撑和稳固作用。镜座可呈马蹄形、圆形、三角形或“丁”字形等，并有较大的底面积和质量。
（2）镜臂：显微镜的脊梁，立于镜座上面，起支撑镜筒、镜台和光学部件的作用。有的还可调节倾斜度，便于观察。凡镜筒能上下升降的显微镜，镜臂也是活动的；而镜台能上下升降的显微镜，镜臂是固定于镜座的。
（3）镜台：又称载物台。是放置标本片的平台，方形或圆形。一般圆形镜台为旋转式，方形镜台为固定式。镜台上面装有标本片固定夹和标本移动器，可使标本片前后左右移动，以利于观察标本的不同部位。有的还装有标尺，可固定标本位置以利于重复观察。镜台中央均留有一孔洞，可让入射光束透过。
（4）镜筒：位于镜臂上端，是一个空心的圆筒，上端可放入目镜，下端接转换器和物镜。从镜筒的下端螺纹口到上端目镜的距离一般为160mm。镜筒有直筒式、单斜筒式、双斜筒式等。
（5）转换器：是一个能转动的圆盘，用于装配物镜，上面有3～5个孔洞，可装上和调换几种不同放大倍数的物镜。
（6）调焦旋钮：用于调节镜筒或镜台上下移动，使物镜焦距准确，以便获得清晰的物像。包括粗调旋钮和细调旋钮，前者升降速度快，只做粗略的调焦；后者升降速度很慢，每转一周，镜筒仅升降0.1mm，可进行细微调焦。
2. 光学系统
（1）光源：新式显微镜的光源通常安装在显微镜的镜座内，通过按钮开关和拉杆来控制。常用灯光或散射日光作光源。在使用白炽灯时，在聚光器下加一蓝色滤光片效果更佳。
（2）反光镜：由凹、平两面圆形镜子组成。通常强光多用平面镜，光线较弱时才用凹面镜。可自由转动方向，以反射光线至聚光器上。镜座内装有内置光源的显微镜则不需反光镜。
（3）聚光器：位于镜台下面，由数个透镜组成。用于集聚由反光镜反射来的光线，使其集中于标本上。聚光器可以上下移动调节，以获得最适光亮度。下面装有虹彩光圈，可任意开闭，用来调节射入聚光器光线的强弱。
（4）物镜：即接物镜，又称镜头，是最重要、最贵重的部件。物镜由许多透镜组成，起着放大标本片上被检物物像（实像）的作用。物镜的性能可以用数值孔径（numerical aperture，NA）来表示。一般物镜上标有放大倍数、数值孔径、镜筒长度和指定使用盖玻片厚度4种数字。在低倍镜、高倍镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径最大，工作距离最短，即最接近标本片（图1-4）。
图1-4 物镜的标注及工作距离
（5）目镜：由1～3片透镜组成，可将经物镜放大的实像进一步放大成虚像，并映入人的眼睛。不同目镜上也标有5×、10×、15×等标志以表示其放大倍数。使用时可根据需要选用适当的目镜。
在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为重要。普通光学显微镜通常配置有几个物镜，可分为干燥系和油浸系两
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