工程细胞生物学_陈志南主编_9787030333025

工程细胞生物学是细胞生物学的重要分支学科，是细胞生物学和细胞工程学的新兴交叉边缘学科。它以细胞生物学的理论和技术体系为基础，以细胞工程学中工程细胞为对象，在分子、细胞等不同层面上，揭示工程细胞的各种生命活动规律，以期按照人们的意图对工程细胞的遗传物质、细胞组分及遗传表型进行重组改造，从而获得有重要应用价值的新型工程细胞表达产物（产品）。可以说，工程细胞生物学是细胞生物学的应用和拓展，同时又为细胞工程学的发展提供重要的理论和技术支撑。因此，工程细胞生物学不仅涉及细胞生物学的基本内容，如生长分化、增殖调控、运输分泌、信号转导和衰老凋亡等基本生命现象，又涵盖细胞工程相关内容，如工程细胞改造及筛选、高密度培养条件、培养体系微环境中的代谢变化等。
《工程细胞生物学》着重介绍工程细胞生物学基本概念、主要内容、研究方法和技术以及应用现状，并拓展介绍了部分重点实验操作和工程知识。书中设计了部分知识拓展框，以丰富学科进展方面的内容。
《工程细胞生物学》可作为生命科学、基础医学相关专业本科生、研究生教材，也可供其他相关领域工作人员参考使用。

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第一章　绪　　论
1.1　工程细胞生物学的基本概念
工程细胞生物学是细胞生物学的重要分支学科，是细胞生物学和细胞工程学的新兴交叉边缘学科。工程细胞生物学的研究内容不仅涉及细胞生物学的基本内容，如细胞的生长分化、增殖调控、运输分泌、信号转导和衰老凋亡等基本生命现象；同时又涵盖细胞工程相关内容，如工程细胞的改造及筛选、高密度培养条件及优化、培养体系微环境中的代谢变化及调节等。
1.1.1　细胞工程和工程细胞的基本概念和分类
1.1.1.1　细胞工程的概念和研究范畴
细胞是包含了全部生命信息和体现生命所有基本特点的独立生命单位，对细胞结构和活动的研究是一切生命科学的重要基础。20世纪70年代末至80年代初，随着细胞生物学和分子生物学突飞猛进的发展，人类已经可以在探索细胞生命活动规律的基础上，在细胞和基因的水平上干预和改造生物的遗传性状，从而依照人类的意愿，设计出新的生物基因蓝图，然后据此制造出新的生命体。正如德国著名哲学家尤根?米特斯特拉斯所指出的：“我们的科学知识正在把我们逐渐推到一种不仅能够知道我们的（生物）本质，而且还能加以改变的位置上。”细胞工程就是这样一门新型学科。
细胞工程，是指应用现代细胞生物学、分子生物学、遗传和发育生物学等理论与方法，通过类似工程学的步骤，在细胞整体水平和细胞器水平上进行遗传操作，重组细胞的结构和内含物，按照人们的意愿改变生物的结构和功能，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织、细胞培养等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种、新产品的生物工程技术。通俗地讲，细胞工程是在细胞水平上做手术，也称细胞操作技术。例如，细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，只需将细胞遗传物质直接转移到受体细胞中，就能形成杂交细胞，因而能提高基因转移效率。
目前细胞工程的主要研究领域包括：①动、植物细胞和组织培养；②细胞融合育种与单克隆抗体；③细胞核移植与克隆；④染色体工程育种；⑤发育基因调控与人体器官培养技术等。细胞工程涉及的技术领域是对细胞不同结构层次的改造，包括细胞整体层次，如细胞培养、细胞融合等；细胞器层次，如核移植、细胞拆合、染色体倍性或组成改变等；分子层次，如基因操作技术等。随着基因工程技术、基因转移技术和干细胞工程技术的发展，细胞工程在理论和应用两方面获得了快速发展。
根据细胞类型的不同，细胞工程具体分为动物细胞工程、植物细胞工程和微生物细胞工程。首先，动物细胞与植物细胞相比，在遗传和生理特性等方面都有很大的不同：①动物细胞没有叶绿体和细胞壁，其物质与能量代谢途径与植物细胞不同；②高等动物的细胞在动物体内生长时，既相互依赖又相互制约，在神经及体液调节下形成了一种非常复杂的内环境，动物细胞在体内受整体调节制约的程度和复杂度，都是植物细胞不能相比的；③动物细胞分化的程度和类别也比植物细胞更高、更复杂，脱分化非常困难；④与植物细胞不同，动物细胞除卵细胞外，都只有遗传上的全能性而没有细胞上的全能性；⑤在体外培养时，除癌细胞和血细胞外，正常的动物细胞都有贴附于支持物生长的特性，并且发生接触抑制，而停止分裂和增殖；⑥所有高等动物细胞都是有寿限的，细胞分裂最多不能超过50代次分化，而植物细胞没有寿限。随着细胞生物学、分子生物学和细胞遗传学研究的日益深入及相关技术的长足发展，动物细胞工程得到了迅速发展，并且在医学研究和实践应用中应用日益广泛。当今，动物细胞工程对提高人类的生活质量和健康水平，发挥着越来越重要的作用。
微生物作为可以独立存在的个体，其生长代谢的特点与植物、动物有着显著的区别，可由其自身完成其基本功能。微生物细胞工程以微生物细胞为研究对象，利用微生物发酵作用，通过现代工程技术手段来生产有用物质，或者把微生物直接应用于生物反应器技术。此外，对微生物细胞的改造也属于微生物细胞工程的研究内容，在遗传育种、微生物发酵、环境保护和农药生产工业上具有重要意义。其应用从人们日常饮用的酒、乳酸、调味的醋、酱油，到抗生素、激素、疫苗等，无一不是微生物发酵的产物；在农业和环境保护方面，用于土壤改良，减少土壤里的残毒，增加土壤肥力和制造对人无毒副作用的微生物农药、微生物肥料和微生物饲料；在农药生产方面，利用细菌、病毒、真菌等病原微生物防治作物的病虫害本身就是一种无污染的新兴生物农药。
1.1.1.2　细胞工程的主要研究内容
细胞工程依遗传操作的不同，可分为细胞融合工程、基因工程、细胞拆合工程、染色体及染色体组工程；依培养技术的不同，可分为大规模细胞培养技术和干细胞工程。
1）细胞融合工程
细胞融合（cellfusion）又称细胞杂交（cellhybridization）。它是指在自然条件下或用人工方法（生物的、物理的、化学的），使两种或两种以上的体细胞合并形成一个细胞，这是一种不经过有性生殖过程而得到杂种细胞的方法。在多细胞生物中，它是一种基本的发育与生理活动。
自发的动物细胞融合概率很低，1962年日本学者冈田善雄发现灭活的仙台病毒可诱导小鼠艾氏腹水癌细胞彼此融合。20世纪60年代后期，研究人员发明了只让杂种细胞存活并传代的技术，该技术使未发生融合的亲本细胞及非两亲本融合的细胞在传代过程中被淘汰。1975年，Milstein和Kohler将小鼠骨髓瘤细胞与羊红细胞免疫过的小鼠淋巴细胞融合，形成杂种细胞，能分泌抗羊红细胞抗体，用于制备单克隆抗体。细胞融合可实现任意细胞间的融合而不受亲缘关系的限制，这就拓宽了遗传变异的范围。细胞融合技术具有巨大的应用潜力，如医学上的单克隆抗体的生产和植物界新物种的培育等。尽管细胞融合的重要性如此之大，但细胞的融合过程是如何在基因控制下发生和发展的，人们一直没有搞清楚。
2）基因工程
基因工程即重组DNA技术，是从基因水平改造生物遗传组成，进而改变细胞的表型，所以将其纳入细胞工程的范畴。它是一种按照人类的意愿，定向改变生物遗传性状的技术工程，即采用类似工程设计的方法，按照预先设计将不同来源的目的基因在体外切割、拼接和重新组合，形成重组基因，然后通过运载体导入宿主细胞，使其在宿主细胞内复制和表达以获得新生物产品、改变生物原有的遗传特性或创造出具有新遗传性状的生物新品种。
3）染色体工程和染色体组工程
染色体工程是按照预先的设计，添加、消除或替代同种或异种染色体的全部或一部分，从而达到定向改变生物遗传性状或选育新品种的目的。它是从染色体水平改变细胞遗传组成的细胞工程技术，主要分为动物染色体工程和植物染色体工程两种。动物染色体工程主要采用对细胞进行显微操作的方法来达到转移基因的目的；而植物染色体工程目前主要是利用传统的杂交、回交等方法来达到改变染色体的目的。染色体工程目前主要应用于植物遗传育种领域。
染色体组工程是在人为设计的技术路线下添加、消除同种或异种染色体组以达到定向改变生物遗传性状的目的。
4）细胞拆合工程
细胞拆合工程又称细胞质工程，研究真核细胞的核、质相互关系，以及细胞器，细胞胞质基因的转移等细胞拆合的技术。该技术主要研究内容是进行细胞组分的分离和融合，研究细胞质和细胞器的添加和替代。具体操作方法是通过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开，再进行不同细胞间核质的重新组合，重建成新细胞。常用的技术就是细胞核移植、胞质体（去核细胞）与完整细胞的融合、细胞器导入完整细胞及大分子直接导入细胞等。其目的是创造出细胞质与细胞核的杂种细胞，这种杂种细胞便有可能出现遗传的变异，出现胞质遗传与胞核遗传的重新组合。细胞拆合最成功的例子是克隆羊“多莉”的诞生。它是通过无性繁殖制备与母体在遗传上一致的克隆动物，即将其母体体细胞的核与去核卵子的细胞质人工重组，借助于卵子的发育能力，制造成的高等动物克隆。
5）干细胞工程
干细胞工程是在细胞培养技术的基础上发展起来的一项新的细胞工程。它是利用干细胞的增殖特性、多分化潜能及其增殖分化的高度有序性，通过体外培养干细胞、诱导干细胞定向分化或利用转基因技术处理干细胞改变其特性的方法，以达到利用干细胞为人类服务的目的。
其主要研究内容，一方面，胚胎干细胞的研究，如建立胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES）系，并利用ES细胞的发育多能性即环境因素对细胞分化发育的影响，定向诱导细胞分化为特定的细胞，如肌细胞、神经细胞等，作为细胞移植的新来源。另一方面，成体干细胞的研究主要包括：成体组织干细胞的分离培养和植入体内，更新机体病变的组织器官恢复正常功能；成体组织干细胞作为基因治疗的靶细胞；研究体内有效激活成体组织干细胞的方法，增强其功能。
6）大规模细胞培养技术
大规模细胞培养技术是细胞工程中重要的组成部分，是在人工条件下高密度大规模培养动、植物细胞，用来生产生物技术产品的技术。如今这一技术已广泛应用于现代生物制药的研究和生产中。它的应用大大减少了用于疾病预防、治疗和诊断的实验动物，为生产疫苗、细胞因子、生物产品乃至人造组织等产品提供了强有力的工具。
根据细胞的生长特性，可分为贴壁细胞和悬浮细胞。就其培养方法而言可概括为悬浮培养和固定化培养。就操作方式而言，可分为分批式、补料?分批或流加式、半连续式、连续灌流式4种操作方式。大规模培养技术的建立，使各种生物制品，如单抗、红细胞生成素、疫苗和病毒杀虫剂等的生产得到了很大的发展。
1.1.1.3　工程细胞的概念和分类
经典意义上，工程细胞即基因工程细胞，是经过改造并被转入了基因的细胞。具体地讲，是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系。通过改造的工程细胞获得或提高了重组蛋白类药物表达的产量和质量。从细胞工程这个大的概念上讲，凡是由细胞工程技术包括细胞融合工程、基因工程、细胞拆合工程和染色体工程构建的细胞，或用于细胞工程培养技术如干细胞工程、大规模培养技术的细胞均属于工程细胞的概念范畴。在本书中，工程细胞主要指后者，即用于大规模培养技术制备生物技术药物的动物细胞。
工程细胞依据组织器官来源包括原核细胞、动物细胞、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞和干细胞等；依据构建方法和应用分为基因工程细胞、组织工程细胞等；依据生长方式可分为贴壁细胞和悬浮细胞；依据生存期分为有限细胞系和永生化细胞系。
尽管近年来工程细胞的构建取得了重大进展，但目前工程细胞的构建都沿袭经验的方法。例如，在工业生物制药领域普遍采用的工程细胞系构建策略仍然需要费时费力的克隆筛选，常常耗时几个月。更为主要的是，没有可靠的预测或模拟克隆株在大规模生物反应器条件下细胞生长特性和产物分泌能力的办法，致使筛选的克隆株在大规模生产条件下难以再现小规模实验条件下相同的细胞生长和产物分泌能力。因而，这些策略都存在很大程度的可变性和不稳定性。究其根本原因在于，缺乏对哺乳动物细胞培养过程变化最本质的理解，缺乏对细胞遗传学机制的理解，缺乏对工程细胞的生物学和生理学行为的理解，特别是缺乏对如何获得能够分泌高产率、高质量蛋白质的工程细胞的细胞与分子生物学机制的理解。
分泌抗体或重组蛋白的工程细胞不同于自然来源的体内细胞，含有有意识的人为的改造，因而其表型及其应用均具有定向性和目的性。另外，工程细胞的获得也是有一定的选择性的。其筛选条件是多种多样的，除了细胞本身的改造以适应细胞的高密度、高产率培养外，还包括培养条件、培养规模、生产和市场需求等。因此随着细胞工程的不断发展，工程细胞的基础和应用研究也不断扩展和深入。因而，对工程细胞生物学行为研究的需求也日益迫切。
1.1.2　工程细胞生物学的概念、内涵和研究范畴
1.1.2.1　工程细胞生物学的概念和内涵
工程细胞生物学以细胞生物学的理论和技术体系为基础，以细胞工程学中的工程细胞为对象，在分子、细胞等不同层面上，揭示工程细胞的各种生命活动规律，以期按照人们的意图对工程细胞的遗传物质、细胞组分及遗传表型进行重组改造，从而获得有重要应用价值的新型工程细胞表达产物（产品）。可以说，工程细胞生物学是细胞生物学的应用和拓展，同时又为细胞工程学的发展提供重要的理论和技术支撑。目前，工程细胞生物学这一领域所涉及的研究内容已成为国外细胞工程及生物制药尤其是抗体制药领域的重要发展方向和趋势。
1.1.2.2　工程细胞生物学研究范畴
工程细胞生物学主要对于工程细胞在体外长期培养条件下的生物学行为的适应与调控机制进行研究。
（1）研究工程细胞在体外规模化培养条件下的细胞生长代谢等分子细胞生物学行为的改变及其调节机制，包括：工程细胞的永生化，工程细胞的葡萄糖转运及代谢、脂代谢及其调节，细胞的氨基酸代谢调节与细胞生长凋亡的关系，无血清培养条件下的细胞体积变大、液泡出现等适应性改变、细胞抵抗“失巢”而黏附聚集成团，以及细胞高密度生长代谢的营养需求等规模化培养中的关键问题。阐明这些现象本质与分子机制，为工程细胞的规模化培养提供全面性、系统性、新颖性和可操作性的理论指导。
（2）研究工程细胞在体外规模化培养条件下的蛋白质合成分泌生物学行为的改变及其调控机制。体外培养条件下的工程细胞其重组蛋白、抗体等合成分泌的生物学行为不同于自然来源的体内B淋巴细胞等，有其特殊性，如体外长期培养和高产率分泌常常导致产物发生质与量的改变，尤其是在进行生物反应器培养时，各种理化参数，如搅拌通气、工艺放大，以及不同培养批次间细胞培养环境及生物反应器操作条件的改变可对抗体的分泌量、分泌抗体的质量均产生重要的影响。阐明这些现象本质与分子机制，为提高工程细胞抗体分泌量及产率提供重要的理论指导。
1.2　工程细胞学与细胞生物学的联系和发展
由于工程细胞生物学是细胞生物学的重要分支学科，是细胞生物学和细胞工程学的新兴交叉边缘学科，因而，细胞生物学和细胞工程学的历史发展即生动展现了工程细胞生物学的历史发展。在其各自的历史发展中，二者交互影响，相互推动，最终形成了一门新兴学科――工程细胞生物学。
1.2.1　细胞生物学的历史发展
从研究内容来看细胞生物学的发展可分为3个层次，即显微水平、超微水平和分子水平。从时间纵轴来看细胞生物学的历史大致可以划分为4个主要的阶段。
第一阶段：细胞的发现及细胞学说的创立。从16世纪后期到19世纪30年代，是细胞发现和细胞知识的积累阶段。通过对大量动、植物的观察，人们逐渐意识到不同的生物都是由形形色色的细胞构成的。
第二阶段：实验细胞学（experimentalcytology）时期。从19世纪30年代到20世纪初期，细胞学说形成后，开辟了一个新的研究领域，在显微水平研究细胞的结构与功能是这一时期的主要特点。形态学、胚胎学和染色体知识的积累，使人们认识了细胞在生命活动中的重要作用。细胞学的发展主要是采用实验的手段研究细胞学的问题，其特点是从形态结构的观察深入到生理功能、生物化学、遗传发育机理的研究。由于实验研究不断同相邻学科结合、相互渗透，导致了一些重要分支学科的建立和发展：细胞遗传学（cytogenetics）、细胞生理学（cytophysiology）、细胞化学（cytochemistry）。1893年Hertwig的专著《细胞与组织》（DieZelleunddieGewebe）出版，标志着细胞学的诞生。其后1896年哥伦比亚大学Wilson编著的《发育与遗传学中的细胞》（TheCellinDevelopmentandHeredity）、1920年墨尔本大学Agar编著的《细胞学》（Cytology）都是这一领域最早的教科书。
第三阶段：细胞生物学的诞生。20世纪30～70年代，电子显微镜技术出现后，把细胞学带入了第三个发展时期，这短短40年间不仅发现了细胞的各类超微结构，而且也认识了细胞膜、线粒体、叶绿体等不同结构的功能，使细胞学发展为细胞生物学。Robertis等1924年出版的《普通细胞学》（GeneralCytology）在1965年第四版的时候定名为《细胞生物学》（CellBiology），这是最早的细胞生物学教材之一。
第四阶段：分子细胞生物学时期。从20世纪70年代基因重组技术的出现到当前，细胞生物学与分子生物学的结合越来越紧密，研究细胞的分子结构及其在生命活动中的作用成为主要任务，基因调控、信号转导、肿瘤生物学、细胞分化和凋亡是当代分子细胞生物学的研究热点。
1.2.1.1　显微镜的发明与细胞的发现没有显微镜就不可能有细胞学诞生。
（1）1590年，荷兰眼镜制造商J.Janssen和Z.Janssen父子制作了第一台复式显微镜。
（2）1665年，英国人Hook首次描述了植物细胞（木栓），命名cella。
（3）1680年，荷兰人Leeuwenhoek当选为英国皇家学会会员，他一生中制作了200多台显微镜和400多个镜头，用设计较好的显微镜观察了许多动植物的活细胞与原生动物。
（4）1752年，英国人Dollond发明消色差显微镜。
（5）1812年，苏格兰人Brewster发明油浸物镜，改进了体视显微镜。
（6）1886年，德国人Abbe发明复消差显微镜，并改进了油浸物镜，至此普通光学显微镜技术基本成熟。
（7）1932年，荷兰籍德国人Zernike成功设计了相差显微镜（phasecontrastmicroscope），并因此获1953年度诺贝尔物理学奖。
（8）1932年，德国人Knoll和Ruska发明电子显微镜，1940年，美国、德国制造出分辨力为0.2nm的商品电子显微镜。
（9）1981年，瑞士人Binnig和Rohrer在IBM苏黎世实验中心（ZurichResearchCenter）发明了扫描隧道显微镜而与电子显微镜发明者Ruska同获1986年度的诺贝尔物理学奖。
1.2.1.2　细胞学说
（1）1809年，法国人Lamark提出：“一切生物体都是由细胞构成的。只有具有细胞的机体，才有生命。”
（2）1802年，法国植物学家BrisseauMilbel指出：“植物的每一部分都有细胞存在。”
（3）1824年，法国生理学家Dutrochet进一步描述了细胞的原理。
（4）1838年，德国植物学教授Schleiden发表“植物发生论”，认为无论怎样复杂的植物都由形形色色的细胞构成。
（5）1838年，德国解剖学教授Schwann通过研究Schleiden的细胞形成学说，提出了“细胞学说”（celltheory）这个术语；并于1939年发表了“关于动植物结构和生长一致性的显微研究”。Schwann提出：有机体是由细胞构成的；细胞是构成有机体的基本单位。
（6）1855年，德国人Virchow提出“一切细胞来源于细胞”的著名论断，进一步完善了细胞学说。把细胞作为生命的一般单位，以及作为动、植物界生命现象的共同基础的这种概念立即得到了普遍的接受。

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